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牛类滋养层干细胞建系的研究
资料类别
   生物农医毕业论文(设计)
课程(专业)
  动物学
关键词
  体外受精|囊胚
适用年级
  研究生
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发布时间
  2014-10-14 20:45:00
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发布人   kj008
 内容简介:     牛类滋养层干细胞建系的研究(硕士学位论文),共103页。
   【摘要】:在哺乳动物胚胎发育过程中,胚胎细胞第一次分化形成内细胞团和滋养外胚层。滋养层干细胞(trophoblast stem cells, TSC)是胎盘细胞的前体细胞,在胎盘发育中有重要作用。有蹄类滋养层干细胞的建系是公认的难点,目前仅在山羊、牛、猪等有蹄类动物获得滋养层细胞的报道,但这些研究并没有对这些细胞系多潜能性或干细胞的特征进行全面鉴定。因此这些细胞系可能处于有别于TSC的分化阶段。本研究比较了不同培养体系对牛类滋养层干细胞(bovine trophoblast stem-like, bTS)建系的影响,特别对利用2i(PD0325901和CHIR99021)获得的牛类滋养层干细胞bTS进行了鉴定,包括碱性磷酸酶检测、核型分析、干细胞多能性标志物基因表达情况和分化潜能的检测,以确定bTS是否为典型的牛类滋养层干细胞。我们采用寡聚核苷酸芯片检测了约23000个牛的转录物,还分别对干细胞多潜能性转录因子OCT4、NANOG、SOX2、CDX2基因的启动子区域甲基化情况进行了初步分析。主要研究成果如下: 1不同的培养体系对牛类滋养层干细胞培养和建系的影响 以DMEM/F12+Neurobasal Medium+N2B27或单独使用DMEM/F12作为基础培养液,添加2i、FGF或Wnt3a,分别以L Wnt-3A/MEF混合细胞或BFF作为饲养层,探讨不同的培养体系对牛滋养层干细胞培养和建系的影响。结果表明:2i培养液结合L Wnt-3A/MEF和添加Wnt3a的2i培养液结合BFF两个培养体系中培养的bTS具有典型的类似小鼠TSC的形态,呈单层扁平生长,体外长期培养没有明显的形态变化,所建的细胞系最长己传至170代;而在去除小分子PD0325901并添加FGF的培养体系,无论使用L Wnt-3A/MEF或BFF作为饲养层,细胞生长缓慢,虽然形态类似小鼠ESC,呈三维立体生长,但均未能传过18代。 2bTS细胞系滋养层干细胞基本特性的鉴定 本研究利用2i培养液结合L Wnt-3A/MEF所建立的细胞系BTS-1具有正常的二倍体核型。在体外长期培养中,该细胞系保持了未分化状态,碱性磷酸酶检测呈阳性,表达干细胞多能基因OCT4、NANOG、SOX2、TRA-1-60、TRA-1-81、 SSEA-1和SSEA-4。同时表达TSC标志基因CDX2、TEAD4、EOMES、ELF5、 GATA3、SMARCA4(BRG1)、ETS2和ERR2。bTS细胞体外可分化为类胚体或贴壁生长并形成双核滋养层细胞。分化的细胞中检测到滋养层分化标志物HAND1、 MASH2和PL-1表达上调。在畸胎瘤实验中,bTS细胞能在NOD-SCID小鼠体内产生胎盘滋养层细胞。我们认为bTS细胞具有滋养层干细胞的基本特征。此外,BTS-1细胞经GFP慢病毒转染并被DOX诱导后,14.81%的细胞能够表达GFP。 3bTS细胞系的基因表达寡聚核苷酸芯片分析和甲基化分析 在BTS-1中,有一些多潜能性基因表达水平低于其在囊胚中的表达水平,但高于它们在BFF中的表达水平,这一类基因包括OCT4、SOX2、GDF3、KLF4、 KLF5、SFRP2、SMAD3、SPARC、STAT3、TBX3和THAP11;在BTS-1细胞和囊胚中,TDGF、MYCN、CCR4、ALPL、SMAD2和SUZl2的表达水平相近,但它们在BTS-1的表达明显高于BFF细胞;TFAP2A、ELF5、CYP11A1、PPARG、 ID2、GCM1、HAND1和THAP11等TSC基因和TR基因在BTS-1细胞中表达很高;牛TR标志物基因,例如TDK和PAG,在BTS-1细胞中有很强的表达。对4种干细胞关键基因的甲基化分析结果显示:与囊胚相比,BTS-1细胞中OCT4.NANOG和SOX2的甲基化程度分别升高168%(P0.001)、120%(P0.05)和116%(P﹤0.001)。CDX2发生了甲基化,但2个启动子区域甲基化程度与囊胚相比分别降低27%(P0.5)和57.7%(P0.001)。与BFF细胞相比,BTS-1细胞中NANOG和SOX2的甲基化程度分别上升179.20%(P0.001)和57.14%(P﹤0.25), CDX2的2个启动子区域甲基化程度分别上升36.36%(P0.005)和136.36%(P0.4),而OCT4下降42.24%(P0.001)。 综合上述研究结果可见:通过2i抑制MEK和GSK3通路,同时使用能分泌Wnt3a的L Wnt-3A细胞作为饲养层或直接在培养液中加入Wnt3a,可能是牛类滋养层干细胞培养和建系的必须条件。
   【关键词】:类滋养层 干细胞 牛2i分化 体外受精 囊胚
  
   -小鼠滋养层干细胞研究概况哺乳动物TSC和ESC都来自早期胚胎,但在胚胎发育的过程中,它们却有不同的分化命运。ESC分化为胎儿三胚层的所有细胞类型和一部分非滋养层细胞来源的胚外组织,而TSC分化为胎儿胚外组织的胎盘细胞[211。对哺乳动物而言,胎盘是母体环境与胎儿进行营养、血液、气体等交换的场所,是胎儿发育必不可少的组织之一胎盘是通过TSC分化而成的多种细胞来完成上述复杂功能的,这些细胞包括滋养层巨细胞(trophoblast giant cells)、海绵滋养层细胞(spongiotrophoblasts)、糖原滋养层细胞(g丨ycogen trophoblast cells)和合胞体滋养层(syncytiotrophoblasts)[气小鼠TSC是目前研宄较多、结果较清晰的TSC。也是研宄其他物种TSC的摹本和范例。因此本章综述主要介绍小鼠TSC培养和相关标志物的研究概况。
   1小鼠滋养层干细胞的研究概况
   在小鼠胚胎囊胚阶段,上皮细胞状的TE细胞包围着ICM细胞。TE细胞中与ICM相接的细胞称为极滋养外胚层细胞(polar trophectoderm)。这部分细胞持续增殖,形成胚外外胚层细胞(extraembryonic ectoderm , ExE)、续(毛)膜锥(ectoplacental cone , EPC)和早期胚体的次级巨细胞(giant cell),其余TE细胞继续增殖为初级巨细胞。小鼠TSC是最早获得的滋养层干细胞,研究也最为透彻。1998年,Tanaka等[3]通过从6.5 dpc的胚胎分离得到ExE,胰酶消化,_接种于原代小鼠胚胎成纤维(mouse embryonicfibroblast, MEF)细胞,添加含20%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和成纤维生长因子4 (fibroblast growth factor 4,FGF4) (25ng/ml)﹥ 肝素(heparin) (1 mg/ml)等因子的 RPMI 1640培养基,获得TSC。该细胞系可分化为巨细胞,而巨细胞正是TR细胞的特征性细胞类型。
   该研究还发现(1)原代MEF细胞可分泌某些未知的因子,它们与FGF4协同作用,共同维持TSC增殖和未分化的状态;(2)这些因子不是FGF4诱导原代MEF细胞分泌的,而是原代MEF细胞本身就可分泌这些因子;(3) FGF4对TSC有直接作用;(4)白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)可维持小鼠ESC未分化状态,但它却不能维持TSC未分化状态。随后更多的研究发现,在小鼠TSC中,雌激素相关受体breceptor Z),ESRRB)[24,25]、尾型同源盒转录因子 2 (caudal homeobox transcription factor 2, CDJC2)、成纤维细胞生长因子受体 2 (fibroblast growth factor receptor!, FCJFi?】)、eomesodermin (□EOMES)是高表达的,而在分化的细胞中表达降低是存在于EPC中、编码一种螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix , bHLH)转录因子的基因。它在分化的TSC中表达上调胎盘催乳素(Placental lactogen 1, PL-1)是巨细胞的标志物之一,在去除FGF4后,PL表达降低皿//是bHLH转录因子之一,在巨细胞发育中起作用,它在ExE细胞中不表达。它在小鼠TSC中也有表达[31]。但最先发现的小鼠TSC中并未检测到ICM和外胚层标志基因OC7V,中胚层标志基因和原始内胚层标志基因因此,该研究获得的小鼠TSC,既有未分化的TR细胞标志基因,例如CDX2,还有TR发生分化之后的细胞具有的标志基因,例如 M45//2,PL-lo
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